在上一期中，我们讨论了细胞转染的应用及其基本分类，今天我们将进一步探讨细胞转染中常见的病毒转染技术。病毒转染是一种高效的细胞转染方法，通过病毒载体将外源基因包裹在病毒外壳中，利用病毒的天然感染能力将外源基因导入宿主细胞，从而实现基因在细胞内的稳定表达。根据不同的病毒载体，病毒转染技术可以分为腺病毒（Adenovirus，ADV）、慢病毒（Lentivirus，LV）、逆转录病毒（Retrovirus，RV）以及腺相关病毒（AAV）等。目前，实验室中广泛应用的是慢病毒转染技术，接下来我们将重点介绍慢病毒的相关内容。

一、慢病毒结构

慢病毒是以HIV-1为基础开发而成的基因治疗载体，属于有包膜的RNA病毒，直径约为80-120nm，呈现二十面体对称的球形结构。慢病毒颗粒最外层是包膜，包膜蛋白决定了病毒感染细胞的特异性，内层依次是基质蛋白和衣壳，最里面存有两条相同的正链RNA和一些关键酶，诸如逆转录酶、整合酶和蛋白酶。

慢病毒具有复杂的基因组，以HIV-1为例，它是一种单链RNA病毒，包含9个基因。其基因组两端各有一个反向末端重复序列（LTR），中间包括gag、pol、env三个编码病毒结构的基因，tat、rev两个调节基因，以及vif、vpr、vpu、nef四个辅助基因。随着对慢病毒基因组的深入研究和转染技术的不断进步，科学家们已进行基因编辑，通过将这些基因分布在不同的质粒中，安全性和包装能力逐渐得到提升，形成了第一代、第二代和第三代慢病毒系统。其中，第二代三质粒系统和第三代四质粒系统被广泛应用。

二、慢病毒复制与包装

为了提高靶细胞转染的效率，首先需要获得高滴度的慢病毒，即进行慢病毒的复制和包装。在此过程中，将三种质粒以一定比例混合后共同转染到293T细胞中，经过48至72小时后，可以通过离心收集含有病毒的上清液，或进一步浓缩病毒。

三、慢病毒感染细胞的过程

慢病毒感染细胞的首要步骤是通过其包膜上的蛋白质与宿主细胞表面的受体结合。融合后，病毒的内部结构蛋白和酶被释放。随后，逆转录酶的作用使慢病毒RNA逆转录为DNA，并与整合酶形成复合物。这一复合物进入宿主细胞核后，由整合酶催化整合至宿主基因组中，外源基因最终在宿主细胞质中得以表达。

四、常见的慢病毒转染类型

我们可以根据不同的实验目的，利用慢病毒转染实现多种应用：

1. 慢病毒荧光转染：将标记的荧光基团（如GFP/mCherry/RFP等）转染到目标细胞中，筛选出的细胞会表现出带有相应荧光蛋白的特性。通过荧光显微镜或流式细胞仪来检测转染后的荧光强度，评估转染效率。

2. 慢病毒荧光素酶转染：将携带荧光素酶编码基因（Luc）的质粒转染后，细胞能产生荧光素酶。通过加入底物荧光素，随后在ATP和荧光素酶的作用下，底物被氧化并发出荧光，适用于活体动物内肿瘤生长和转移的监测。

3. 慢病毒细胞永生化转染：通过病毒感染、辐射或化学致癌等方法，打破原代细胞的分裂次数限制，使细胞获得无限增殖能力。利用慢病毒将外源性永生化基因导入特定细胞，从而获得均一的永生化细胞株。

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