### 一、细胞培养条件

不朽情缘MG细胞培养的细胞名称、特性及冻存条件包括以下要素：

细胞特性：贴壁生长

冻存条件：无血清冻存液

培养体系：基础培养基为1:1混合的MCDB105培养基（含15g/L碳酸氢钠）和M199培养基（含22g/L碳酸氢钠），加15%的优质胎牛血清及1%的双抗。

传代方法：建议初次传代比例为1:2，通常在两天后进行换液。备注：使用无菌离心管收集培养基，以便进行过渡对比培养。如果对比结果不佳，建议直接购买不朽情缘MG的完全培养基。

### 二、细胞处理流程

收到细胞后，待细胞状态稳定后，灌满完全培养液并封闭瓶口是运输细胞的最佳方式。使用75%酒精对整个细胞瓶进行消毒，随后在超净工作台内进行严格的无菌操作。将细胞瓶放置在37℃、5% CO2的培养箱中静置3-4小时以稳定细胞状态，接着进行观察。建议拍摄细胞的不同倍数照片，保存至少一张40x、100x和200x的照片，前三天的照片是重要的售后依据，未提供照片则默认细胞状态良好。传代后建议用原瓶的完全培养基进行对比培养，换液后瓶盖要稍微松开。

### 三、细胞培养步骤

a. 细胞传代： 若细胞汇合度未超过80%，将瓶内的完全培养液收集至离心管中，留5ml培养基并放入37℃、5% CO2孵箱中培育；若细胞密度超过80%，可进行传代，具体步骤如下：

1. 弃去培养上清，用不含钙、镁的PBS清洗细胞1-2次。
2. 添加0.25%胰蛋白酶消化液约1-2ml，置于37℃培养箱中消化1-2分钟，观察细胞消化情况；如细胞大部分变圆并脱落，迅速回到操作台，轻敲培养瓶后加入5ml以上的完全培养基终止消化。
3. 轻轻吹打使细胞完全脱落后吸出，然后将悬液转移至离心管中，在1000RPM条件下离心5分钟；弃去上清，补加1-2mL完全培养基重悬。
4. 按1:2的比例分瓶传代（两个T25瓶），补充新的完全培养基至5-8ml/瓶，最终放入37℃、5% CO2的细胞培养箱中培养。

b. 细胞冻存：细胞生长至覆盖培养瓶的80%面积时，弃去T25培养瓶中的培养液，用PBS清洗一次。添加0.25%胰蛋白酶消化液约1ml，观察直至细胞回缩变圆后加入5ml培养基终止消化，然后轻轻吹打使细胞脱落，转移至15ml离心管，在1000rpm离心5分钟。弃去上清，加入1ml不朽情缘MG无血清冻存液（货号：C7001），混匀后转入冻存管中。将冻存细胞在-80℃冰箱中保存，如果后续需要转入液氮罐，需在-80℃存放24小时以上再转入液氮罐。

### 细胞复苏流程

从液氮中取出细胞冻存管（注意佩戴防护装备），迅速置于37℃水浴中解冻，直至冻存管中无结晶。随后用75%酒精擦拭冻存管外壁，并将细胞转移至含5ml完全培养基的15ml离心管中，1000rpm离心5分钟，弃去上清后用5ml完全培养基重悬，接种至T25培养瓶，放于37℃、5% CO2细胞培养箱中继续培养；第二天更换新鲜完全培养基进行后续培养。

### 注意事项

部分细胞贴壁不牢，运输过程中可能发生细胞脱落，属于正常现象。如脱落较多，可将所有培养液收集至离心管，收集上清进行过渡培养，沉淀后加入胰酶再置于细胞培养箱中继续培养。

### 售后条款

1）细胞问题的重发条件与标准：

1. 在运输过程中出现的问题，如细胞丢失、瓶身破损或严重漏液，均可重发；
2. 细胞污染问题，需在收到产品48小时内提供真实的实验结果，经核实后可重发；
3. 常温发货的细胞，如静置24小时、干冰冻存发货的细胞复苏后24小时大多数细胞未存活，需提供真实细胞状态照片，重发；
4. 如干冰冻存发货的细胞复苏后24小时内或常温发货的细胞静置4小时未开封出现污染，均可重发；
5. 关于细胞活性的问题，需在收到产品7天内提供真实实验结果，并使用台盼蓝染色法确认细胞活力，核实后重发；
6. 细胞收到当天及第2、3天请拍照，若3天未通知则视为产品合格。若在4-7天内出现问题，提供收到细胞前三天的照片及相关操作步骤，与技术人员沟通后由技术人员判定责任，若为我方责任则重发。若属双方责任则需协商处理或按照合同价的50%进行重发。

2）不予重发的情况：

1. 客户造成细胞污染，无法重发；
2. 客户不正确操作导致细胞状态不良，无法重发；
3. 非不朽情缘MG推荐的细胞培养体系导致细胞状态不佳，无法重发；
4. 细胞状态不良且未提供细胞培养前三天的照片，无法重发；
5. 在细胞培养期间经过其他处理，无法重发；
6. 细胞收到后两天内未通知的，无法重发；
7. 具体情况需视情况而定。